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多能干细胞快速冻存方案,快码住!

多能干细胞快速冻存方案,快码住!

  • 分类:新闻
  • 作者:尊龙凯时 - 人生就是搏!生物
  • 来源:尊龙凯时 - 人生就是搏!生物
  • 发布时间:2024-01-15
  • 访问量:94

【概要描述】

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以下文章来源于干细胞者说(公众号)

将细胞、组织或者器官冷冻在-80℃尤其是-140℃以下,并保证其存活能力的过程称为细胞的冷冻保存。细胞低温保存的隐患之一来自于低温状态下水结晶对细胞器和细胞膜的损伤。

根据避免细胞内外水结晶的原理,常用于人多能干细胞冻存的方法包括玻璃化冷冻法和慢冻法两种。

01

玻璃化冷冻法是一种快速冷却方法,通过使用高浓度的冷冻保护剂诱导组织细胞转变为玻璃样凝固态,并在-196℃条件下快速冷却的过程。在整个快速的冷却和复温过程中,细胞内外均无冰晶产生,有效避免了冷冻损伤,细胞活性得以保留。玻璃化冷冻法需要精确的时间控制,因此将其应用于临床级细胞的保存具有挑战性。

02

慢冻法是一种较经典的冷冻方法,通过使用低浓度的冷冻保护剂(如10% DMSO)以约 –1°C/min的速度冷冻细胞。在这种情况下,细胞外的水首先冻结,从而增加了细胞外空间的渗透压,细胞内外空间之间的渗透间隙导致细胞脱水,因此可以减少细胞内冰晶的形成。

 

下文以CryoStor® CS10细胞冻存液为例演示如何通过慢冻法对人多能干细胞进行冷冻保存。CryoStor® CS10是一种不含血清和动物成分的临床级别的细胞冻存液,推荐用于人胚胎和诱导多能干细胞等敏感细胞类型的冷冻保存。

 



实验材料

 

  • CryoStor® CS10(产品号 #07930)

  • 温和的细胞解离试剂GCDR(产品号 #07174)

  • mTeSR™ Plus(产品号 #100-0276)

  • 冻存管(产品号 #100-0091)

  • 15 mL离心管(产品号 #38009)

  • 2 mL无菌移液器吸头

  • 细胞程序降温盒

  • -150℃冷冻柜或液氮罐

 

 



实验步骤

 

开始之前:以下步骤是以在6孔板中通过mTeSR™ Plus培养的人ESC或iPSC为例。培养物应在准备传代时收获并冷冻保存。如使用其他规格培养皿,请相应调整体积。

1.在板底部标记培养细胞的分化区域。

2.通过移液器枪头的尖端刮擦去除分化区域。

*避免将培养板从培养箱中取出一次超过15分钟。

3.吸出剩余的培养基。向每个孔中添加1 mL GCDR,并在室温下孵育5-8分钟。

*使用不同细胞系、其他传代试剂或其他培养基时,孵育时间可能会有所不同。

4.吸出GCDR,并添加1 mL的mTeSR™ Plus。用血清移液管或细胞刮刀轻轻刮擦集落,并确保细胞聚集体体积不能过小。

5.使用2 mL血清移液管将聚集体转移到15 mL离心管中。

6.在室温下以300 xg离心5分钟。轻轻吸出上清液,保持沉淀完整。

7.添加6 mL预冷的CryoStor® CS10到沉淀中。

*使用前用70%乙醇或异丙醇擦拭瓶子外部。

8.使用2 mL血清移液管移出沉淀,尽量避免造成细胞聚集体的破碎。

9.使用2 mL血清移液管轻轻将细胞悬浮液转移至冻存管中。

10.使用以下其中一种方法冷冻保存细胞聚集体:

A.标准慢冻方案:以大约-1°C/min的速度进行程序降温,然后在-135°C(液氮)或更低的温度下长期储存。不建议在-80°C长期储存。

B.多步骤方案:细胞在-20°C下保存2小时,然后在-80°C下保存2小时,最后在-135°C(液氮)或更低的温度下长期储存。

 



【关于尊龙凯时 - 人生就是搏!生物】

北京尊龙凯时 - 人生就是搏!生物科技有限公司成立于2018年,由清华大学医学院杜亚楠教授科研团队领衔创建,清华大学参股共建。核心技术源于清华大学科技成果转化,并凭借此项技术荣登中国科协“科创中国”先导技术榜。作为国家级高新技术企业、国家级专精特新“小巨人”企业、潜在独角兽企业,更获得国家科技部多项重点研发专项支持。

作为高质量三维细胞制造专家,尊龙凯时 - 人生就是搏!生物提供基于3D微载体的一站式定制化细胞规模化扩增整体解决方案,打造了原创3D细胞智造平台,实现规模化、自动化、智能化、密闭式的细胞药物及其衍生品生产制备,以此帮助全球客户建立最为先进的细胞药物生产线。在开创【百亿量级】干细胞制备工艺管线后,加速向【千亿量级】进发,致力于以3D细胞规模化智造技术赋能细胞与基因治疗产业,惠及更多患者。

尊龙凯时 - 人生就是搏!生物的产品与服务,已广泛应用于基因与细胞治疗、细胞外囊泡、疫苗及蛋白产品等生产的上游工艺开发。同时,在再生医学、类器官与食品科技(细胞培养肉等)领域也具有广泛应用前景。并且,目前已助力多家细胞与基因治疗企业进行IND申报。

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