【前言】

近期，由北京中医药大学中医学院王婧宇副研究员团队在Pharmaceutics期刊上【IF：5.4】，发表了题为“基于3D生物反应器规模化生产小细胞外囊泡递送人参皂苷Rg1治疗阿霉素诱导的心脏损伤”的文章。

原文链接：

http://doi.org/10.3390/pharmaceutics16050593

【Part1 研究背景】

阿霉素（DOX）作为一线抗肿瘤药常用于乳腺癌和淋巴瘤等多种癌症的治疗，但其存在诱发心脏毒性等副作用。目前经FDA批准，治疗阿霉素诱导心脏毒性(DIC)的唯一药物是右丙亚胺，又因其存在继发恶性肿瘤的风险而临床应用受限，因此迫切需要开发更有效、更安全的DIC治疗方法。

间充质干细胞(MSCs) 来源的小细胞外囊泡(sEVs)已被广泛用于心血管治疗，保护受损的心肌细胞免受凋亡，但sEVs的低产量和高消耗阻碍了它们的应用。因此开发一种大规模生产系统，以提高MSC-sEVs产量，成为推动其更好地应用于疾病治疗的重中之重。

3D多孔微载体具有三维立体结构及更大的比表面积，支持细胞贴附生长，为细胞提供更适宜的生长环境，更增加了细胞生长空间，有效提升细胞培养质效，快速收获MSCs和MSC-sEVs，有效解决sEVs产量低的应用难题。基于3D多孔微载体、配合自动化生物反应器的三维动态培养体系更已在大规模细胞生产制备中得到广泛应用。

人参皂苷Rg1是从人参中分离得到的一种化合物， 人参皂苷Rg1已被证明在各种类型的损伤后对心肌细胞具有保护作用，但由于口服生物利用度低和半衰期短，阻碍了临床应用，因此本研究基于sEVs的药物递送功能，负载递送人参皂苷Rg1以提高DIC的治疗效果，从而克服sEVs消耗高的应用瓶颈。

【Part2 研究方法】

本研究使用来自尊龙凯时 - 人生就是搏!生物的3D微载体和自动化生物反应器进行3D细胞动态培养，同时对3D-MSCs的细胞活力、细胞产量进行检测，对3D-MSsC的生物标记物进行流式分析。

收集细胞上清，通过超速离心法进行sEVs的分离，通过TEM、NTA、WB等技术进行sEVs的表征鉴定。随后通过电穿孔法和HPLC进行载药平台构建。

通过CCK-8、流式细胞术、全自动活细胞成像技术等检测H9c2心肌细胞的细胞活力、细胞凋亡、细胞增殖情况，进行一系列的药效评价。

【Part3 研究结果】

3.1 3D生物反应器规模化培养MSCs

为了实现sEVs的大规模生产，本研究选择尊龙凯时 - 人生就是搏!生物的动态生物反应器3D培养扩增人脐带来源的MSCs，同时进行常规2D培养作为对照（图1A）。3D细胞培养系统包括多孔微载体和旋转生物反应瓶 (图1B)。Calcein-AM/PI染色结果表明3D-MSCs在连续培养过程中呈增殖状态，且细胞活力有所增加( (图1C、D)。在3D培养系统中，第5天的活细胞总数达到6亿个，与第0天相比增加了约7.5倍(图1E)。综上所述，3D细胞培养系统实现了MSCs的规模化生产。

图1：MSCs的规模化生产

为了验证3D培养不影响MSCs表面标记物的表达，收获2D-MSCs和3D-MSCs进行流式表型分析。结果表明，与2D-MSCs相似，95%以上的3D-MSCs表达CD73+、CD90+和CD105+，CD14−、CD34−、CD19−、CD45−和HLA-DR−阴性表达的比例不超过2%(图2 A、B)。这验证了从3D培养系统中收获的MSCs能够在培养扩增的过程中维持MSCs的生物学特性。

图2：MSCs的流式表型鉴定

3.2 3D生物反应器实现了sEVs的大规模生产

随后，我们收集2D-MSCs和3D-MSCs的条件培养基，采用差速超速离心法提取sEVs，并通过TEM、WB和NTA技术进行表征鉴定，这些实验结果证实了从3D细胞培养系统不会影响sEVs的生物学特性（图3）。

根据NTA结果进行统计分析可知，当同时各自投入相同数量（8 × 10⁷）的细胞时，3D培养系统所需耗材仅为4 个500 ml的生物反应瓶，而2D培养系统需要132个T75培养瓶。一个实验者同时独立操作132个T75培养瓶是一个巨大的挑战，因此2D培养的可实现性低，这也反应出了3D培养可以降低人力物力和时间的投入。3D培养系统收获的sEVs总颗粒数和蛋白总量约是2D培养系统的2倍，实验时间减少了8倍。这提示着3D培养系统可以实现MSCs和sEVs的大规模生产，降低人力、物力和空间的投入，显著提高了实验效率（表1）。

图3：sEVs的提取与表征

表1. 2D vs 3D培养系统中sEVs产量统计对比

3.3 3D-sEVs抑制H9c2心肌细胞凋亡，减轻DOX的心脏损伤

随后，我们进行3D-sEVs治疗DIC的药效评价(图4A)。首先构建了DIC体外细胞模型(图4B)，并验证了3D- sEVs可被H9c2心肌细胞快速摄取(图4B)。CCK-8 (图4D)和流式细胞术 (图4E-G)结果表明3D-sEVs抑制了DOX诱导的心肌细胞凋亡，对受损的心肌细胞起到了很好的保护作用。

图4. 3D-sEVs治疗DIC的药效评价

3.4 人参皂苷Rg1抑制心肌细胞凋亡，促进心肌细胞增殖，减轻DOX心脏损伤

接下来，我们评价了人参皂苷Rg1对DOX诱导的心肌损伤的保护作用。CCK8结果表明和DOX模型组相比，5~20µg/mL人参皂苷Rg1提高了H9c2细胞活力(图5A)。Annexin V/PI染色显示，与DOX模型组比较，5~20µg/mL的人参皂苷Rg1显著提高细胞活力，降低细胞凋亡(图5B-D)。此外，全自动细胞成像系统表明5~20µg/mL人参皂苷Rg1的相对细胞数高于DOX模型组，且在24 h时，细胞数增加到约75% (图5F、G)。因此验证了人参皂苷Rg1具有减轻细胞凋亡、促进细胞增殖、保护心肌细胞免受DOX损伤的作用。

图5. 人参皂苷Rg1治疗DIC的药效评价

3.5Rg1-sEVs减轻了DOX诱导的H9c2细胞损伤

为构建sEVs的药物递送系统，采用高效液相色谱法对电穿孔法、超声法和共孵育法三种方法的载药效率进行了评估。结果表明，电穿孔的载药率最高，达21% (图6)。因此后续采用电穿孔法进行药物包封。

图6. sEVs药物递送平台构建

随后进行了Rg1-sEVs的药效评价。CCK-8结果表明，与DOX组相比，Rg1-sEVs的细胞活力显著提升，且高于单独的sEVs组和单独的Rg1组(图7A)。全自动活细胞成像系统结果表明，在24 h内，Rg1-sEVs和Rg1处理组的H9c2相对细胞数量高于DOX模型组(图7B)。在24 h时，10 µg/mL的Rg1-sEVs与20 µg/mL的游离Rg1具有相当的心脏保护作用(图7C)。流式细胞术结果表明，与单独的sEVs组和单独的Rg1组相比，10µg/mL的Rg1-sEVs显著降低凋亡率(图7D-F)。因此，实验证明了单独的sEVs和单独的Rg1相比，Rg1-sEVs显示出更好的心脏保护功能，这表明sEVs的药物递送在未来临床应用中具有很好的研究前景。

图7：MSCs的规模化生产

【Part4 研究结论】

本研究成功地证明了基于生物反应器的3D细胞培养系统可以实现MSC-sEVs的规模化生产，而3D-sEVs可以作为载体递送人参皂苷Rg1，显著减轻了DOX诱导的心脏毒性。

与游离的人参皂苷Rg1和sEVs相比，Rg1-sEVs具有更为显著的心脏保护功能，这提示着3D细胞培养系统在sEVs的规模化生产中具备很好的应用前景。

【Part5 研究团队】

北京中医药大学中医学院王婧宇副研究员和李春教授为本论文通讯作者，王婧宇副研究员课题组邸云凤（2021级硕士）为本论文的第一作者。

【Part6 研究技术支持】

3D TableTrix® 微载体

①更仿生：由数万颗弹性三维多孔微载体组成，孔隙率>90%，粒径大小可控于50-500μm区间， 均一度≤100μm，形成真正的3D仿生培养。

②资质全：该产品已获得2项CDE药用辅料资质，登记号为【F20200000496；F20210000003】，3项FDA原料药及药用辅料资质，登记号为【DMF:037798、035481；MF:29721】

③易收获：特异性降解技术裂解微载体，收获相较于传统方式更高效更温和。

④更安全：拥有权威机构出具的裂解残留检测、细胞毒性、热原反应、遗传毒性、体内免疫毒理学相关质量评价报告以及溶血性、皮下注射局部刺激性、主动全身过敏性、腹腔注射给药毒性等安全性评价报告。

⑤易放大：通过3D培养方式，结合尊龙凯时 - 人生就是搏!生物3D细胞智造平台全线产品可以实现全自动封闭式大规模细胞培养，实现百亿量级细胞收获。

3D FloTrix® miniFLEX 4通道生物反应器：

①超薄设计：超薄主机高度仅48mm，扁平化设计可进一步提高培养箱空间利用率。

②不锈钢机身：主机采用全不锈钢设计，易清洁好擦拭，满足洁净需求。

③适配一次性反应瓶：适配尊龙凯时 - 人生就是搏!自研透气内置叶轮一次性反应瓶。其中，搭配125/250ml透气内置叶轮一次性反应瓶，可在一台170L培养箱放置2台设备，实现共8个瓶位的培养体系。

④同步关联：开启关联功能，并结合配方工艺的使用，可将多个瓶位统一工艺模式，一键操作即可实现多瓶位同步启动/暂停/停止，高效完成对照试验。

各瓶位间也可任意关联操作，如图示：瓶位1、瓶位2、瓶位3使用工艺一关联，达到三个瓶位同步运行的效果。

⑤工艺预设：配备十种配方工艺和四种自定义工艺，共计两类步骤模式，满足多步骤、多循环工艺需求。

参数可修改，断电可保存，单步骤时间最高可达1000min,循环次数高达100次，操作便捷。

⑥可编程工艺：搅拌程序可编程、参数自定义。满足间速模式／双速模式／间恒速模式不同工艺需求，实现工艺条件的探索和优化。

⑦双语系统：系统支持中英文双语，一键切换，灵活便捷。

⑧实时信息：系统实时显示每个瓶位的工艺参数：时间、转速、工艺、步骤等。

【尊龙凯时 - 人生就是搏!生物】