为了治疗严重威胁生命的疾病，干细胞产品的开发和临床转化正在迅速发展。中国目前正在进行临床研究的干细胞产品包括来自人胚胎干细胞（hESC）和人诱导多能干细胞（hiPSC），以及能够组织特异性分化的间充质干细胞（MSCs）、胎儿干细胞和成体干细胞。

干细胞产品的主要作用方式是用干细胞衍生的功能细胞替换或修复各种疾病中受损的组织/细胞。MSCs是否属于干细胞，目前仍存在争议。毕竟，MSCs的“干性”高度依赖于组织来源。

与多能干细胞相比，成体干细胞的增殖和分化能力有限，但分化方向明确。

胎儿干细胞比成人干细胞具有更高的增殖能力，但胎儿组织来源有限，不稳定，涉及复杂的伦理问题，因此未得到广泛应用。

从监管角度来看，美国食品和药品监管局（FDA）尚未批准市场上的任何干细胞产品，而FDA监管的干细胞产品正在进行数百项临床试验。

自2009年以来，欧洲药物管理局（EMA）批准了市场上的自体干细胞治疗产品，如软骨细胞移植、Holoclar，并且没有批准hPSC衍生的干细胞产品。

2014年，日本完成了第一次自体hiPSC衍生视网膜色素上皮细胞移植以治疗黄斑变性，并于2017年在日本卫生、劳动和福利部的监督下完成了第一次同种异体hiPSC细胞移植。

在中国，目前有两种监管方法来监督干细胞临床研究。一种方法是使用“双重归档系统”收集由国家医药产品管理局和国家卫生委员会共同管理的干细胞研究医疗机构和医生发起的临床研究项目的文件。另一种方法是，申办方可以将研究新药（IND）提交给国家医药产品管理局药物评估中心（CDE），如果没有提出异议，则在60个工作日审查后允许进行临床试验。在IND档案中，可以提供先前由医生发起的临床研究数据，以支持细胞产品的安全性和有效性。

CMC对干细胞产品的研究主要集中在制造和质量控制方面。从制造业的角度看，干细胞的分离、体外培养和诱导分化技术实现了向各种功能细胞的可控分化，处于特定分化阶段的细胞（如早期前体细胞、成熟功能细胞等）是中间细胞产物。供体对供体的变化和干细胞产品的批次对批次的变化使得很难确定合适的制造工艺和质量标准。大规模生产是一项挑战。根据现有的科学知识和临床经验，来自不同来源的细胞差异很大，并且各种细胞类型的风险水平也不同。例如，hPSC衍生细胞产品的临床应用的缺点是，由于其多分化潜能和四瘤形成能力，其理论致瘤风险显著较高。

本文综述了目前在中国的干细胞产品规范中考虑的要点。使用生命周期管理策略说明了详细考虑事项，包括原材料和辅料的管理、制造过程、质量研究和控制、稳定性、包装和装运（图1）。

原材料、起始材料和辅料

应严格审核原材料，并制定内部规范。原材料应追溯至采购、制造、包装、储存和运输全过程。对于直接接触细胞的材料（比如细胞因子、化学分子、抗生素、磁珠或基质凝胶），首选医药级或临床级材料。对于研究级试剂（包括培养基、肽、抗体、消化酶、血清），应清楚其组成，并建议进行全面测试以确保质量。ROCK抑制剂（如Y27632），通常在干细胞消化过程中添加，以减少细胞死亡。鉴于在长时间传代期间，添加ROCK抑制剂对细胞的影响尚不清楚，建议提供支持数据来解释其使用的合理性。

避免使用动物源性材料，除非有正当理由，并且无需任何外来病毒污染的证明。应明确添加血清的必要性和剂量的合理性，并进行残留血清检测。鼓励在干细胞产品制造中使用无血清和化学定义的细胞培养用血清替代品。建议选择合成消化酶替代动物源性材料。

▉饲养层细胞

许多干细胞传统上是在失活的饲养层细胞上培养的（如经辐照的小鼠胚胎成纤维细胞/人成纤维细胞）。随着2D和3D培养的普及，目前已使用细胞外基质（如Matrigel、Geltrex和Vitronectin等）建立了无饲养层培养系统。建议使用化学定义的基质，以防止动物源性材料的偶然污染。例如，Matrigel来源于小鼠肿瘤细胞，如果使用，则需要对小鼠病毒进行全面测试，并对致瘤性进行风险评估。如果使用馈电单元，应建立单元组并进行彻底测试。应研究和验证辐照剂量和其他细胞失活过程，以保持饲养层细胞的批间质量一致性。

起始材料指用于制造干细胞产品的供体组织/细胞。根据现有的监管指南，捐赠者筛查应包括对各种病理学和遗传病的检测。对于以hPSC为起始原料的产品，应提供hPSC生产线的来源和建立文件，应根据GMP建立hPSC细胞库，应明确规定细胞代次或细胞倍增时间，应参照国际标准对细胞库进行全面测试。应进行细胞系稳定性研究，包括细胞培养性能和遗传分析，以支持细胞系的一致性超过建议的累积群体加倍限制。

细胞产品通常含有冷冻保存剂（包括PBS、DMSO、HSA等），建议在配方中加入药用辅料。

针对IND阶段，必要时需要对未广泛使用的赋形剂进行毒性研究和评估。针对NDA阶段，辅料需要注册，技术审查将根据2020年7月生效的最新中国药品注册法规并行进行。某些干细胞产品涉及递送装置，包括避免免疫攻击的封装技术，或支持体内细胞生长的支架。在中国，干细胞产品的设备部分将由NMPA医疗设备评估中心（CMDE）共同审查。

3.制造工艺

用于人体临床试验的细胞产品必须按照GMP生产。通常，干细胞产品的制造过程包括供体细胞分离、细胞扩增、细胞库建立、细胞分化、纯化、配方、冷冻保存、储存和输送。应彻底研究工艺开发和优化、关键步骤和中间体的控制、杂质的去除。工艺流程和参数的基本原理将在IND应用期间进行技术审查。

4.过程开发

在开发的早期阶段，通常采用实验室规模的制造工艺，例如使用小型培养皿/烧瓶生产数量有限的细胞。在这种情况下，很难确保此类制造过程的再现性、无菌操作的控制、产品质量维护。对于临床批量生产，建议优化工艺，调整规模，保持批间质量一致性，以满足临床试验需要。大型细胞培养设备通常包括平底多层培养瓶（细胞工厂）、灌注生物反应器、搅拌生物反应器等[5]。多层细胞工厂可生产高达1010-1012个细胞，有限培养面积的灌注式生物反应器可生产约108个细胞。建议根据所需剂量、培养方法（单层培养、悬浮培养或2D、3D培养）、培养基变化频率以及是否需要实时pH或O2监测来选择用于临床批量生产的细胞培养设备。

在培养临床级hPSCs的过程中，细胞克隆的选择和分化细胞的去除至关重要。嵌合克隆和异常增殖克隆应在传代前鉴定并去除，否则细胞培养系统中可能会出现大量异常增殖细胞。在传代操作方面，克隆机械分离、化学/酶消化等可应用于hPSC。消化后的细胞块大小、传代率、机械力强度、消化酶浓度和离心力以及培养基变化、细胞因子、pH、CO2浓度、细胞密度都是可能的关键工艺参数。细胞密度、克隆形状、边缘平滑度可能是监测hPSC未分化状态的关键指标。重要的是，应仔细研究和限制hPSC的通道数。hPSC细胞在长期培养（例如几个月）中容易积累基因突变，具有特定突变的细胞的快速生长可能导致克隆异质性，甚至形成显性克隆[6]。因此，一般建议在hPSC细胞扩增过程中缩短时间，限制传代次数，并在细胞状态稳定时及时冻结hPSC细胞库。

许多MSC都是大规模生产的。同样，限制骨髓间充质干细胞的传代数量也是至关重要的。随着传代次数或培养时间的增加，建议分析MSC形态、增殖特征、染色体、致瘤性和癌基因突变的发生情况，以明确体外细胞扩增的时间和传代限制。值得注意的是，MSC的长期培养可能有细胞恶性转化的风险。例如，研究表明，骨髓来源的骨髓间充质干细胞体外培养106周后，其形态、增殖率、表型和分化能力发生了显著变化，抑癌基因p16和p21启动子区域的甲基化增加，细胞移植到免疫缺陷小鼠体内后可形成肿瘤样组织[7]。由于高代细胞更容易发生恶性转化，建议缩短培养时间，持续监测细胞倍增时间和遗传表型。

重要的是，IND档案中需要临床/毒性批次的制造程序和标准操作规程以及详细参数。随着临床试验的进行，可以进一步深入研究过程和过程验证的稳健性。

5.过程控制

大多数开放式制造系统和半封闭式系统都需要适当的过程中生物负载控制，以避免污染或交叉污染。如有必要，还应监测细胞的遗传稳定性、特异性不定病毒或其他细胞类型的可能污染。与干细胞相关的重编程和分化过程通常包括许多分化阶段、遗传操作、频繁的培养基置换操作和长期培养时间。精确控制生产过程中不同阶段（生殖层阶段、前体细胞阶段、中间分化阶段和终末分化阶段）的细胞命运是一项重大挑战。人类使用的最终干细胞产品主要由前体细胞或终末分化细胞组成。在某些情况下，需要防止这些细胞在培养系统中进一步分化/转分化。因此，建议在适当的时间点控制每个阶段细胞的分化潜能和标记物表达。例如，建议在细胞分离后对细胞特性和生存能力进行表征，收获前可在细胞上检测细胞标记物、杂质（残留抗生素和细胞因子等）、分化能力或细胞因子分泌活性等指标，以确保细胞质量符合要求。此外，应仔细评估供体细胞库和细胞收获的致瘤性风险。

6.配方工艺

应根据预期给药途径明确说明每种赋形剂的基本原理，并评估赋形剂与细胞之间的相容性。如果主办方提及上市细胞产品的配方，则需要通过稳定性数据评估和支持配方的适用性。在早期的小规模配方工艺开发中，经常使用手动填充工艺。生产设备、人员操作、冷冻保存和转移管理应设计良好，以确保临床批次不受任何污染。人工灌装时应注意保证细胞含量的一致性和均匀性。应加强过程控制，确保无菌生产过程得到监控。在进行大规模生产时，鼓励开发自动化灌装工艺，以确保安全性和质量一致性。

7.质量研究和控制

干细胞产品的质量表征和控制涉及微生物安全性、特性、分子标记、效力、纯度和杂质。

8.微生物安全

关于临床受试者严重不良反应的大量报告表明，不良反应主要是由于干细胞产品的微生物污染，包括细菌、真菌、支原体和细菌内毒素的污染。干细胞给药前的微生物检测是确保患者安全的重要控制方法。如今，广泛使用的BacT/Alert 3D自动培养系统等快速无菌检测方法缩短了培养时间，并且在检测能力方面与药典方法没有显著差异[8]。支原体快速检测方法包括核酸扩增技术和支原体代谢酶活性检测。在中国，如果替代方法未得到充分验证，建议同时使用无菌和支原体检测的药典方法进行释放检测。当释放试验仅使用快速释放方法时，需要根据药典验证分析适用性和性能，以证明快速释放方法可以取代药典方法。对于可能含有残留抗生素的产品，应在验证中评估抗生素对无菌检测的抑制作用。

9.身份和分子标记

干细胞的身份可以通过细胞形态学观察、干细胞标记物检测、STR、体外分化潜能分析、畸胎瘤形成实验等来检测。使用STR验证细胞来源时，建议在尽可能多的STR位点比较受试细胞和原始细胞（或衍生细胞）的基因分型结果。

从学术角度来看，随着生命科学的发展，许多类型的干细胞没有得到彻底的表征，新的标记物不断被发现。干细胞标记物的表达受多种因素影响，如供体变异、标记物在细胞内的分布、分离和培养操作、培养基组成、细胞分化阶段和不同的衰老水平。例如，在通过不同重编程方法产生的hiPSC细胞中观察到不同的干细胞标记物表达水平和分化潜能[9]。当细胞暴露于特定生长因子或缺氧等培养条件下时，干细胞标记物发生变化[10]。因此，文献中报告的特定类型细胞的标记物可能不会出现在生产细胞批次上。建议赞助商研究临床批次的分子标记物，并选择能够识别功能细胞类型的主要代表性标记物。对于分子标记物的分析，通常使用流式细胞术、免疫荧光法。试验方法应表明标记物在细胞中的分布，应采用细胞培养和试验的标准操作方案、抗体的来源和类型以及适当的阴性和阳性对照。

10.致瘤性分析

干细胞产品的致瘤性是阻碍其临床转化的主要因素。多种途径可导致肿瘤形成。一方面，干细胞增殖分化过程中的恶性转化可能导致肿瘤的形成；另一方面，最终产物中残留的未分化干细胞可能形成畸胎瘤，尤其是hPSC衍生的细胞产物。

致瘤性检测方法包括畸胎瘤形成分析、软琼脂分析、核型分析（G显带）或荧光原位杂交（FISH）等。建议在细胞培养阶段、细胞库试验和释放试验中使用正交法检测细胞的致瘤性。对于染色体分析，分析细胞的数量对分析的灵敏度至关重要。根据中国药典，至少50个中期细胞应进行核型显微镜分析，大约500个中期细胞应用于检查多倍体的发生率。

根据1700个hiPSC和hESC细胞的核型分析数据，一些核型异常的hiPSC和hESC细胞系可能具有相似的染色体变异特征，如12号染色体重复[9]。对于hPSC产品，建议进行全面的遗传分析，包括染色体拷贝数变异分析（CNV）、FISH、外显子测序、单核苷酸多态性阵列或单细胞测序技术等，以检测遗传变异。对于恶性转化问题，建议深入研究生产工艺和产品质量控制，持续监测细胞染色体稳定性。

目前，据报道，去除hPSC的方法包括添加小分子抑制剂以特异性诱导hPSC死亡/凋亡[11]，或使用苛刻的培养条件（如缺氧、低葡萄糖等）去除干细胞并富集终末分化细胞[12]。对于hiPSC衍生产品，在hiPSC重编程过程中使用安全开关，例如自杀基因与转录因子基因的融合，也是避免转录因子持续表达从而降低肿瘤发生风险的可能解决方案。然而，安全开关的引入也增加了外源基因整合的风险，使用时有必要仔细评估风险效益比[13]。建议干细胞产品规范包括使用流式细胞术分析、免疫组织化学或多潜能标记物（Myc、OCT4、SSEA4、Nanog等）定量聚合酶链反应分析检测hPSC衍生产品中的残留干细胞。对于体外多次传代的细胞，有限代内的低代、中代和高代细胞均需进行致瘤性和残留hPSC分析，以降低肿瘤形成的风险。

11.纯度和杂质

干细胞产品中的杂质包括产品相关杂质和工艺相关杂质，影响产品的安全性和有效性，如残留的高风险材料和非靶细胞。最终细胞产品中的非靶细胞通常包括饲养细胞、成纤维细胞、死亡细胞、残留的种子干细胞和未知细胞。如果无法准确检测每种细胞类型的含量，则应确定细胞的表型，并根据最大剂量进行安全性评估。由于有限的制造经验、来源、制备工艺、给药途径的变化以及不同的临床需求，批量分析数据可用于设定IND阶段非靶细胞百分比的验收标准。对于与工艺相关的杂质，包括培养基成分、生长因子、消化酶、残留珠粒等，建议累积多个收获后批次的测试结果，或根据工艺参数（洗涤循环次数或稀释次数）计算理论残留量。在应用IND之前，应进行杂质检测方法的初步验证。

12.效力

效价测定是为了理想地反映细胞产物的作用机制（MOA），通常包括细胞替代治疗的体外分化潜能测定、功能蛋白表达测定、细胞因子分泌测定和生理活性测定。一些产品打算用功能性细胞替代受损细胞或组织发挥作用，而另一些产品可能通过分泌活性因子来实现体内功能。因此，效力的研究需要个案评估。替代相对效价试验也可用于MOA未知的产品。

在临床前阶段，虽然标准参考可能不可用，但建议建立具有可接受变化的初级效价测定。相关技术方法包括免疫荧光染色、形态学观察、流式细胞术分析、电生理分析等。应设置阳性和阴性对照，并仔细设计效价检测前的细胞处理操作。对于心肌细胞和神经细胞，电生理活性试验适用于测量细胞产物的功效，但很难定量表征细胞功能。动物模型也可用于测量细胞产品的修复/再生能力，以评估体内的生物活性。对于MSC细胞的免疫调节功能，科学界提出可以结合不同的方法（如核糖核酸定量分析、标记物检测、分泌蛋白分析和免疫细胞反应分析等）来表征MSC细胞的免疫功能[14]。此外，MSC的分泌含量是反映其旁分泌作用的常见指标。

13.规格

制造过程的所有阶段都伴随着适当的过程中控制[15]。关于多能干细胞库的质量标准，可以从银行机构找到相关标准，包括中国国家干细胞资源库[16]、国际干细胞研究学会（ISSCR）和国际干细胞库倡议（ISCBI）[17]。对于生产过程中中间产品的质量控制，建议在不同时间点检测安全项目（如无菌、支原体和内毒素）。此外，建议密切监测细胞分化潜能和遗传稳定性。就最终产品的规格而言，建议包括外观、无菌、支原体、内毒素、外来剂、特性、致瘤性、细胞数量、细胞活力、纯度、效力、杂质残留量、非靶细胞等测试项目。然而，在早期临床试验期间，有限的批次数量和少量的患者使得设置适当的规格具有挑战性，并且在以后的开发过程中可以进行更多的细化。

14.稳定性、包装和装运

干细胞产品的稳定性研究应涵盖所有制造阶段，包括供体组织采集、组织保存、组织/细胞运输、细胞库保存、中间细胞样品、冷冻保存和最终产品的使用稳定性。建议使用具有代表性的细胞治疗产品样品进行稳定性研究，这些产品具有与临床批次相似的液体体积和细胞密度范围（如有）。产品的运输稳定性研究主要集中在从细胞收集地点到生产地点再到临床使用地点的运输过程。应提供稳定性数据，以支持IND档案中的运输条件和时间。

袋、管广泛用于包装干细胞产品，有时根据不同的给药途径涉及支架和设备。为了避免免疫反应，封装也被用来包装细胞产品。申请临床试验时，建议提供容器封闭系统的基本信息，如来源、质量规范和生物安全数据。为确保临床使用的安全性，接受产品与由相同材料制成的小型容器/包装系统之间兼容性的初步评估。应特别注意辅料（如二甲基亚砜）与容器之间的相容性。如果容器封闭系统广泛用于包装电池产品，初步稳定性研究结果可用于评估包装材料的相容性。在申请市场授权之前，应根据相关指南，根据成分、细胞配方、保存条件和设备完成完整的兼容性研究。

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MSCs 药物发展概况

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适用于 MSCs 产品的法规和指南

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化学、制造和控制（CMC）

干细胞产品的原材料多种多样，制造工艺复杂，质量控制方法千差万别。在人类使用干细胞产品之前，需要不断努力提高干细胞产品的安全性/有效性。目前，对供人类使用的干细胞产品进行长期风险评估的经验有限。在增加干细胞产品进入临床试验之前，安全性评估至关重要。尽管hESC和hiPSC在理论上有可能产生各种类型的成体细胞，但由于培养基更换方案复杂、操作程序复杂、培养时间长，在控制分化过程中遇到了许多问题。类器官、三维培养技术、气液界面培养、器官芯片和其他新的细胞/组织产品和技术也对制造过程的标准化提出了挑战。干细胞产品的CMC评价需要全面考虑在获取供体细胞或组织、生产过程、储存和运输、临床交付操作中引入的风险，以确保产品的有效生命周期管理。

对于使用病毒载体和其他基因转导系统进行基因工程以进行重编程和基因修饰/重塑的干细胞产品，应注意安全风险，如复制能力强的病毒、插入突变和癌基因激活。对于静脉注射产品，肺部细胞的积聚和全身异位组织的形成是潜在的问题。

此外，目前还没有关于如何选择致瘤/致癌研究的动物模型的科学共识，因为合适的模型应该确保细胞能够在体内长期存活，以研究是否可能发生潜在的肿瘤形成。应考虑生理学、解剖学、与人类的可比性、对人类细胞产物的免疫耐受性、给药途径的可行性、免疫缺陷动物的适用性、患病动物等因素来论证模型的合理性。值得注意的是，在动物给药之前，细胞产品可能会经历一系列操作，如清洗、传代和培养基更换。因此，动物实验用供试品应作为临床批次同等对待。

中国最早的干细胞产品法规可追溯到1993年，当时中国卫生部发布了《临床研究用细胞和基因治疗产品质量控制指南》。2003年，中国食品药品监督管理局发布了《人体细胞治疗研究与质量控制指南》[18]。2015年，中国卫生和计划生育部与中国食品药品监督管理局联合发布了《干细胞临床研究管理指南》，并“干细胞医药产品和临床前研究质量控制指南”，以规范干细胞临床研究和质量控制。2017年，中国食品药品监督管理局发布了“细胞治疗产品研究和评价指南”“，提出了细胞药物注册和应用的技术要求。2019年，更新了《中华人民共和国药品管理法》，强调了药物的生命周期管理。建议建立一个强大的监测系统，以符合要求。2020年，但书更新了《药品注册条例》，规定市场授权持有人对药品开发负有主要责任，相关文件将首先说明细胞产品的档案要求。

随着全球老龄化人口的增加和细胞治疗的快速发展，临床对再生药物的需求日益增长。要成功地对再生医疗产品进行监管，需要有健全的原则。对于发起人，尤其是初创公司，鼓励与监管机构进行早期互动，以大幅加快干细胞产品的发展。尽管需要做出更多努力来解决CMC问题并继续进行临床探索，但相信随着中国药品审查制度的持续改革政策和干细胞产品监管政策的逐步全球趋同[19]，以及细胞治疗科学生物学研究和产业的进步，将开发越来越多的干细胞产品，使数百万医疗需求未得到满足的患者受益。