【前言】

矽肺是由于长期吸入高浓度的游离二氧化硅引起的，是中国死亡率和发病率最高的一种尘肺病。尽管矽肺有明确的病因，但其发病机制复杂，目前尚无有效的治疗方法。因此，迫切需要找到一种可能有效的治疗方法。

矽肺的特点是硅结节和肺纤维化（PF）。PF的特点是肺实质的破坏，细胞外基质（ECM）的沉积，以及纤维细胞和肺泡上皮细胞表型的巨大变化。成纤维细胞的激活被认为是驱动PF纤维化进展的主要因素，抑制成纤维细胞的激活也可以影响各种治疗策略的效果。

而外泌体是由细胞内多泡体(multivesicular body，MVB) 与细胞膜融合后，释放到ECM中的膜性囊泡，大小为40-150nm。多种类型细胞均可以分泌外泌体，这些外泌体将功能蛋白、mRNA和/或microRNA（miRNA）转移到受体细胞。外泌体介导的物质转移已被认为是细胞间交流的一个重要途径。

最近的研究表明：间充质干细胞可以分泌外泌体来修复PF。以往研究中也发现：来自三维培养的脐带间充质干细胞外泌体（hucMSCs-Exos）可以改善硅诱导的小鼠PF模型的PF水平。

原文链接：http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0147651322001427

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【Part1—外泌体制备及评估】

本实验旨在评估hucMSC-Exos对成纤维细胞激活的影响，对照组采用来自MRC-5的外泌体（MRC-5-Exos），两种外泌体均基于三维动态培养方法获得（图1：A/B），并进行了TEM（图1：C/F）、NTA（图1：D/G）、标志物的检测（图1：E/H）。

图1.细胞的三维培养和外泌体的鉴定

▌A: 3D FloTrix® miniSpin生物反应器

▌B: hucMSCs和MRC-5细胞的3D培养。

▌C/F：用TEM捕捉外泌体的图像。

▌D/G：通过NTA，平均颗粒的大小分别显示为123.9和133.5纳米。

▌E/H：通过Western印迹检测到CD81、CD63和TSG101在外泌体中的表达，Calnexin（一种阴性标记）在外泌体中的表达量很小；然而，通过Western印迹检测，它在hucMSCs和MRC-5细胞中的表达量相对较高。

【Part2—外泌体治疗方法及检测指标】

为了比较激活成纤维细胞和PF的抑制作用，我们在小鼠的矽肺模型中进行了研究，用hucMSC-Exos或MRC-5-Exos治疗30天。

当成纤维细胞被激活并转化为肌成纤维细胞时，细胞会分泌过多的细胞外基质蛋白，以及α-平滑肌作用（α-SMA）、胶原蛋白I和纤连蛋白（FN）的表达，这可以作为肌成纤维细胞存在的指标，所以我们检测了小鼠肺部的α-SMA、胶原蛋白I和FN的蛋白表达水平。

【Part3—结果】

3.1 与对照组相比，hucMSCExos处理后，二氧化硅增加的HYP和α-SMA、I型胶原和FN水平的蛋白表达明显降低。说明，hucMSC-Exos具有抑制小鼠成纤维细胞的活化和减轻二氧化硅诱导的小鼠PF的潜在作用（图2）

3.2 使用免疫荧光染色确定hucMSC-Exos或MRC-5-Exos均可被小鼠胚胎成纤维细胞（NIH-3T3）细胞内化（图2）

图2. HucMSC-Exos抑制成纤维细胞活化以缓解硅诱导的小鼠PF的作用

▌A: 在hucMSC-Exos或MRC-5-Exos治疗后，小鼠注入二氧化硅的实验过程。

▌B: 小鼠肺的H&E和Masson染色（200×和400×）。

▌C: Masson染色阳性胶原纤维的百分比。

▌D: HYP的含量。

▌EF：采用Westernblot法检测四组小鼠I型胶原和FN型胶原沉积标志物的表达。数据以每组的平均值± SD，n = 3表示。* P < 0.05（与对照组相比），# P < 0.05（与二氧化硅组相比）。

3.3 与对照组相比，硅组α-SMA、I型胶原和FN表达上调；而硅hucMSC-+组（硅+MRC-5-Exos组）α-SMA、I和FN型胶原水平较硅组降低。说明，hucMSC-Exos抑制了二氧化硅对NIH-3T3细胞中诱导的成纤维细胞的活化（图3）

图3.HucMSC-Exos抑制了成纤维细胞的活化

▌A/B：在体外跟踪hucMSC-Exos或MRC-5-Exos，用Dil红色荧光染料（Dil：激发=549nm；发射=565nm）来标记hucMSC-Exos或MRC-5-Exos。使用Hoechest蓝色荧光染料来标记细胞核。

▌BF：明场。

▌C/D：伤口愈合试验。

▌E/F：Transwell试验。

▌G/H：对NIH3T3细胞中α-SMA的免疫荧光染色（绿色）和半定量分析。

▌I/J：通过Western blotting检测NIH-3T3细胞中hucMSC- Exos的α-SMA、胶原I和FN的表达，每组n=3，* P＜0.05（与对照组相比），# P＜0.05（与二氧化硅组相比）。

3.4 新一代测序技术分析了hucMSCs-Exos和MRC-5-Exos之间不同表达的miRNAs。我们发现miRNA let-7i-5p和TGFβ受体1（TGFBR1）之间的相互作用参与了PF。Let-7i-5p负责激活成纤维细胞，TGFBR1有一个保守的3′与let-7i-5p互补的同源序列（UTR）。因此，我们推测TGFBR1可能作为硅活化成纤维细胞中hucMSC-Exos中let-7i-5p的潜在靶点（图4）。

图4. 外泌体-miRNAs的不同表达和基因富集的分析

▌A: 差异miRNA表达的火山图。

▌B: 差异miRNA表达的热图。

▌C: 靶基因预测结果的维恩图谱。

▌D: 候选靶基因KEGG通路的气泡图谱。

▌E: 与纤维化疾病相关的差异miRNA表达。

▌F: 在纤维化疾病小鼠中的差异表达miRNAs（DEmiRNA）的验证。

▌G: let-7i-5p的候选靶基因。

▌H: TGFBR1 3结合位点示意图′-UTR到let-7-5p和TGFBR1 3的突变′-UTR。

▌G: 在转染了let-7i-5p模拟物和TGFBR1 3的细胞中，检测了TGFBR1的荧光素酶活性′-UTR质粒。数据以平均± SD（n = 3）表示。* P <0.05（与对照组相比）。

3.5 由于TGFBR1与let-7i-5p结合，我们研究了hucMSC-Exos是否干扰了TGFβ 1通路。我们预测hucMSC-Exos介导的let-7i-5p有助于TGFBR1的活性。正如预期的那样，IHC和Western blotting的结果显示，小鼠暴露于二氧化硅后，TGFBR1和磷酸化Smad3（P-Smad3）的水平增加，在用hucMSC-Exos处理后，其水平下降，但用MRC-5-Exos处理后，TGFBR1和P-Smad3的水平并没有改变。说明，TGFBR1/Smad3信号通路与小鼠和NIH-3T3细胞中硅诱导的PF相关（图5）。

图5.在小鼠和NIH-3T3细胞中，与硅诱导的PF相关的TGFBR1/Smad3信号通路

▌A-D：采用IHC和免疫印迹法检测小鼠TGFBR1和P-Smad3水平。

▌E/F：免疫印迹法检测NIH-3T3细胞中TGFBR1和P-Smad3的水平。所有数据均以平均± SD（n = 3）表示。*P<0.05（与对照组相比）和#P<0.05（与二氧化硅组相比）。

3.6 为了证明let-7i-5p在hucMSC-Exos介导纤维化过程中的调控作用，我们在hucMSCs中使用其抑制剂对let-7i-5p进行基因修饰。荧光素酶报告基因分析表明，let-7i-5p以TGFBR1为靶点。免疫印迹法检测NIH-3T3细胞中α-SMA、I型胶原、 FN、TGFBR1和PSmad3的水平。结果显示，与硅+hucMSC-Exos-let-7i-5p抑制剂组相比，硅+hucMSC-Exos-let-7i-5p抑制剂+siRNA TGFBR1组中α-SMA、I型胶原、FN、TGFBR1和P-Smad3蛋白水平降低（P < 0.05）。说明，hucMSC-Exos let-7i-5p通过TGFBR1调控NIH-3T3细胞中P-Smad3的激活，并抑制成纤维细胞的激活（图6）。

图6.HucMSC-Exos let-7i-5p通过TGFBR1/Smad3信号通路抑制NIH-3T3细胞中成纤维细胞的激活。

▌A: 不同诱导剂处理let-7i-5p的实验过程。

▌B: 采用RT-qPCR，检测let-7i-5p的表达。

▌C/D：采用免疫印迹法，检测α-SMA、I型胶原、FN、TGFBR1和P-Smad3的相对蛋白水平。*P<0.05（与对照组相比），#P<0.05（与二氧化硅组相比），&P<0.05（与二氧化硅hucMSC-Exos组相比）。

▌E: 不同诱导剂处理TGFBR1或Smad3 siRNA的实验过程。

▌F/G：采用免疫印迹法，检测α-SMA、I型胶原、FN、 TGFBR1和P-Smad3的相对蛋白水平。* P < 0.05（与对照组相比），# P < 0.05（与二氧化硅组相比），&：P < 0.05（与二氧化硅hucMSC-Exos组相比），^：P < 0.05（与二氧化硅+ hucMSC-Exos let-7i-5p抑制剂组相比）

▌H/I-hucMSC-Exos let-7i-5p抑制剂组：采用免疫印迹法，检测α-SMA、I型胶原、FN和P-Smad3的相对蛋白水平。每组n = 3，*P<0.05（与对照组相比），#P<0.05（与二氧化硅组相比）。

【Part4—讨论】

外泌体的细胞间转移是一种成熟的介导细胞间通信的机制，其由质膜分泌并进行自由运输。一些证据来源支持细胞外miRNA分泌现象，miRNA（和外泌体）的细胞间通信不仅存在于同一生物体的细胞之间，也存在于不同的生物体之间。在研究中，已经证实这些外泌体可以被成纤维细胞吸收。

Let-7是最早发现的miRNA之一，其家族是最大的miRNA家族之一。hucMSC-Exos中的let-7i-5p可能干扰TGF-β信号通路以阻断纤维化，从而进一步改变它们的基因表达表型和谱。

TGFβ 1是PF最有效和研究最充分的诱导剂之一，它可以激活成纤维细胞，促进ECM的产生。抑制TGFBR1可以预防或减少不同组织的纤维化，从而导致Smad3磷酸化水平降低。在研究中， Smad3在二氧化硅诱导的成纤维细胞的激活中也发挥了重要作用。GFBR1作为一种丝氨酸/苏氨酸激酶被激活，它可以磷酸化细胞质中的Smad3（P-Smad3）。P-Smad3是Smad3激活的主要形式。在没有Smad3基因的小鼠中，可以观察到P-Smad3信号的显著衰减。TGF-β触发了Smad3的激活和磷酸化。

【Part5—结论】

综上所述，二氧化硅暴露诱导小鼠和NIH-3T3细胞中let-7i-5p水平降低，三维培养hucMSC-Exos可通过靶向TGFBR1使let-7i-5p进入成纤维细胞，导致Samd3水平降低。最终减少了由二氧化硅诱导的成纤维细胞的活化。因此，三维培养hucMSC-Exos可通过抑制成纤维细胞的活化，对二氧化硅诱导的PF患者起到积极的治疗作用 。

【Part6—研究相关产品】

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